一、实验前准备 

在进行 CCK8/MTT 实验前，实验材料的准备是关键的第一步。选择优质、合适的材料，能够为实验的顺利进行奠定坚实基础： 

1. 细胞：细胞状态是实验成功的关键。应选用对数生长期的细胞，此时细胞活力强、代谢活跃，可确保实验结果准确可靠。细胞培养需严格控制温度、湿度、二氧化碳浓度等条件，维持稳定适宜的生长环境。同时，定期检查细胞，防止支原体污染，以免干扰实验结果。例如，支原体污染会导致细胞代谢异常，影响CCK8/MTT实验结果。

2. 试剂：CCK8和MTT试剂质量直接影响实验成败。使用时需确保试剂在有效期内，且储存条件符合要求。CCK8试剂需避光保存，MTT试剂避免反复冻融。使用前应充分混匀试剂，保证浓度均匀一致。此外，培养基、血清等其他试剂也需选择质量可靠的产品，并按正确比例配制。培养基成分和pH值会影响细胞生长，血清的质量和批次差异可能导致实验结果不稳走。 

3. 耗材：96孔板是常用耗材，其质量和特性会影响实验结果。应选择表面适合细胞贴壁的96孔板，确保细胞均匀分布，同时注意孔板密封性，防止液体蒸发或污染。移液枪、枪头、离心管等其他耗材也需选用高质量产品，保证移液准确性和实验无菌环境。例如，移枪精度不准确会导致加样量偏差，进而影响实验结果。 

此外，仪器设备的正常运行是实验成功的重要保障。在实验前，务必对相关仪器设备进行仔细检查： 

1. 酶标仪：酶标仪是检测吸光度的核心设备，其性能直接影响实验数据的可靠性。使用前需检查波长准确性、吸光度准确性和重复性，可通过标准品校准确保仪器性能达标。同时，清洁检测孔，避免杂质或残留液体干扰检测。波长不准确会导致吸光度测量“偏差，进而影响实验结果。 

2. CO2培养箱：CO2培养箱为细胞生长提供稳定环境，其温度、湿度和CO2浓度的稳定性至关重要。需定期检查并确保温度维持在37℃左右、度>95%、CO2浓度稳定在5%，可使用温度计、湿度计和CO2检测仪进行监测。同时，定期清洁消毒培养箱，防止微生物污染。温度波动过大可能影响细胞生长和代谢，导致实验结果不准确。 

3. 离心机：离心机用于细胞分离和洗涤，其转速和离心力的准确性对细胞完整性和活性至关重要。使用前需检查离心机转速是否准确、离心桶是否平衡，可通过标准样品测试确保性能正常。同时，注意离心机的清洁和维护，避免残留细胞或液体污染后续实验。转速不准确可能导致细胞分离不完全或受损，影响实验结果。 

二、CCK8实验避坑要点 

1. 试剂保存与使用：

CCK8试剂中的水溶性四唑盐对光敏感，光照会促使其分解，降低试剂活性。因此，储存时需置于-20℃避光环境中。使用前，应提前取出试剂使其缓回温至室温，避免温度剧烈变化影响试剂稳定性，进而干扰实验结果。移液时必须使用无菌枪头，防止微生物污染。微生物污染会导致试剂中营养成分被消耗并产生代谢废物，使试剂失效，无法正常使用。 

2. 细胞处理：
细胞密度的精准控制对CCK8实验至关重要。细胞密度过高会导致培养基营养迅速耗尽，细胞因营养匮乏而生长抑制甚至死亡，从而产生假阴性结果；而细胞密度过低会使检测信号过弱，影响结果的准确性和可靠性。为确定最佳接种量，建议科研人员进行预实验。一般而言，96孔板每孔接种500~5000个细胞较为适直，但具体数量需根据细胞类型、特性及实验目的灵活调整，例如，生长速度快的细胞可适当减少接种量，生长缓慢的细胞则需增加接种量。在铺板时，确保细胞均匀分布是关键。可将接种后的96孔板置于37℃培养箱中孵育1~2小时，待细胞状态稳定后再加入试剂进行后续实验，以避免细胞分布不均造成的误差，确保实验结果的可靠性。 

3. 反应条件优化：
CCK8与细胞的孵育时间一般为1~4小时。孵育时间过短时，细胞内脱氢酶无法充分将WST-8还原为黄色甲瓒产物，导致显色不足和检测信号弱，无法准确反映细胞活力；而育时间过长，细胞可能因长时间接触试剂而受损甚至死亡，影响实验结果。为确定最佳孵育时间，建议每2小时用酶标仪在450nm波长处测定一次吸光度，观察吸光度变化趋势，找到吸光度稳定且能准确反映细胞活力的时间点。

培养基中的酚红“或高浓度血清可能干扰吸光度，影响实验结果。因此，需设置空白对照(含培养基和CCK8试剂但无细胞的孔)，通过对比空白对照孔和实验孔的吸光度，排除干扰因素。若实验中使用的药物本身有色，需提前检测其与CCK8试剂的兼容性，观察两者混合后是否发生颜色变化或其他化学反应。若不兼容，可能导致吸光度异常，需采取相应措施，如更换药物、调整浓度或改变实验方法，以确保实验结果可靠。 

4. 数据解读与验证

为减少操作误差并提高实验结果的可靠性，每组实验应至少设置3个复孔，并进行多次独立实验。对多次实验数据取平均值，可使结果更接近真实值。例如，在研究药物对细胞增殖的影响时，设置多个复孔可降低加样误差和细胞分布不均等因素的干扰，而多次独立实验则进一步验证结果的重复性和稳定性，确保结论可靠。

对于药物处理实验，建议设置多个时间点（如24h、48h、72h），绘制细胞生长曲线。这可动态反映细胞在不同时间点的状态变化，揭示药物对细胞增殖或毒性的时效规律。例如，通过细胞生长曲线可判断药物是促进还是抑制细胞生长。

为提高实验结果的可信度，可结合台盼蓝染色或MTT法等其他检测方法进行交叉验证。不同检测方法基于不同原理，CCK8法通过检测细胞内脱氢酶活性反映细胞活力，而台盼蓝染色法通过区分活细胞和死细胞来评估细胞活力。多种方法相互补充，可更全面了解细胞状态，提升实验结果的准确性和可靠性。 

5. 安全与环保注意

CCK8试剂含有微量毒性物质，操作时科研人员需佩戴手套，避免接触皮肤。若不接触，应立即用大量清水冲洗并及时就医。实验废弃液含CCK8试剂及细胞代谢产物等有害物质，必须按实验室规范妥善处理。随意丢弃废弃液会污染环境，破坏生态平衡。例如，废弃液中的毒性物质可能污染土壤和水源，危害动植物生长。因此，应收集废弃液，采用化学中和、降解或交由专业机构处理，确保环境安全。 

三、MTT实验避坑要点 

MTT实验作为细胞研究领域的经典方法，在细胞活力检测、药物选和细胞毒性评估等方面发挥着重要作用。然而，其操作流程复杂且精细，任何环节的微小差都可能导致结果误差甚至错误，影响研究的准确性和可靠性。因此，科研人员需深入了解并有效规進MTT实验中的潜在“陷阱”，以确保实验成功并获取可靠数据。 

1. 试剂准备：
MTT溶液的配制和保存是实验成功的关键。MTT溶液通常需现用现配，若需保存，应配制成5mg/ml浓度，置于-20℃避光保存（可用避光袋或黑纸包表）。配制时，使用无菌PBS或无酚红培养基溶解MTT，称取0.5gMTT溶于100 ml溶剂中，并用0.22μm滤膜过滤除菌。MTT对细菌极为敏感，污染后细菌代谢会干扰实验结果。此外，免MTT溶液反复冻，以免活性降低结晶析出，影响实验准确性。 

2. 细胞接种：
细胞接种密度对实验结果影响显著。细胞增殖实验每孔接种2000~5000个细胞，细胞毒性实验每孔接种5000~10000个细胞，但需根据细胞种类、大小和增殖速度灵活调整。生长快的细胞可适当降低接种密度，生长慢的细胞则需增加密度。接种时，确保细胞悬液混匀，避免细胞沉淀导致分布不均，同时严格遵守无菌操作，防止交叉污染，动作轻柔避免气泡，以免影响细胞分布和生长。 

3. MTT孵育：

MTT孵育时间和条件至关重要。通常孵育时间为4小时左右，但需根据细胞系和实验目的调整，孵育时间过短，MTT还原不完全，检测信号弱；育时间过长，细胞可能因代谢产物积累或营养耗尽而死亡。孵育过程中，确保细胞培养箱温度、湿度和CO:浓度稳定，避免频繁开关箱门，以免环境变化影响细胞代谢和MTT反应。 

4. 溶解甲瓒

甲瓒结晶的溶解效果直接影响实验结果。常用二甲基亚砜（DMSO）作为溶解剂，加入后需充分振荡至结晶完全溶解。振荡时控制力度和时间，避免细胞破碎或结晶未完全溶解。对于难溶的结晶，可将96孔板置于37℃孵箱中孵育10~20分钟，但避免DMSO挥发。溶解过程中避免气泡，以免干扰吸光度测定。

5. 比色检测：

比色检测是MTT实验的最后关键步骤。使用酶标仪测定吸光度时，选择490nm或570nm波长确保仪器准确性和稳定性，定期校准和维护。检测前擦拭96孔板，避免污渍或残留液体干扰结果，尽量在避光条件下进行检测，避免光线干扰。每次检测前预热酶标仪，确保其处于稳定工作状态。 

四、对比与总结 

CCK8和MTT实验虽均用于检测细胞活力与增殖，但在原理、操作及结果分析上存在差异。 

CCK8实验操作简便、检测时间短、对细胞毒性小，且生成的水溶性甲瓒产物可减少误差；而MTT实验成本低，但操作繁琐，需用有机溶剂溶解甲结晶，对细胞毒性较大。 

科研人员在选择方法时，应综合考虑实验目的、细胞类型和样本数量等因素，以确定最适合的实验方案。 

在CCK8和MTT实验中，任何细节疏忽都可能导致结果偏差。从材料选择与准备，到操作规范再到结果分析与验证，每个环节都需严格遵守规程，避免人为误差。只有如此，才能确保实验结果的准确性和可靠性，为科研提供有力支持。同时，科研人员也应不断总结经验，探索新技术提升实验水平，为生命科学研究贡献力量。

文章出自：验外实包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/